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穩(wěn)定細胞株構(gòu)建---高產(chǎn)細胞株的秘密
日期：2025-05-02 20:09
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摘要：
穩(wěn)定細胞株構(gòu)建---高產(chǎn)細胞株的秘密
生物制藥行業(yè)在*近20年發(fā)展迅速，特別是基于哺乳動物細胞表達的產(chǎn)品市場份額不斷擴大。哺乳動物細胞（如CHO）的生產(chǎn)工藝開發(fā)過程通常包括分子構(gòu)建、穩(wěn)定細胞株篩選、上游發(fā)酵工藝開發(fā)、下游純化工藝開發(fā)以及制劑工藝的開發(fā)。在這些階段中，分子構(gòu)建和穩(wěn)定細胞株篩選做為一個產(chǎn)品研發(fā)的起始部分，顯得極為重要。一株穩(wěn)定高產(chǎn)的工程細胞株不僅能顯著增加單位體積產(chǎn)量，降低產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，并且還可以降低下游純化過程的復(fù)雜度，確保獲得**，高品質(zhì)的生物制品。
生物制藥行業(yè)在*近20年發(fā)展迅速，特別是基于哺乳動物細胞表達的產(chǎn)品市場份額不斷擴大。哺乳動物細胞（如CHO）的生產(chǎn)工藝開發(fā)過程通常包括分子構(gòu)建、穩(wěn)定細胞株篩選、上游發(fā)酵工藝開發(fā)、下游純化工藝開發(fā)以及制劑工藝的開發(fā)。在這些階段中，分子構(gòu)建和穩(wěn)定細胞株篩選做為一個產(chǎn)品研發(fā)的起始部分，顯得極為重要。一株穩(wěn)定高產(chǎn)的工程細胞株不僅能顯著增加單位體積產(chǎn)量，降低產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，并且還可以降低下游純化過程的復(fù)雜度，確保獲得**，高品質(zhì)的生物制品。
宿主細胞與重組蛋白生產(chǎn)
動物細胞是生產(chǎn)治療性重組蛋白的強有力工具。為與小分子藥物區(qū)別開來，治療性蛋白、疫苗以及細胞治療產(chǎn)品統(tǒng)稱為生物制品。宿主細胞的選擇和改造對于提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量來說至關(guān)重要。因此必須對細胞進行篩選，選出具有高表達量和良好生長特性的細胞。在此我們主要討論適用于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白的細胞株的篩選。
工業(yè)上重組蛋白的制備主要有兩種方式：瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染經(jīng)常用于制備少量蛋白（多達克級）用于藥物開發(fā)早期的蛋白活性或動物實驗。瞬時轉(zhuǎn)染并不產(chǎn)生克隆細胞株，它只是暫時將編碼外源蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入已有的細胞株里面（比如HEK293或COS細胞）。隨著細胞的分裂外源基因不斷丟失，蛋白產(chǎn)量較低，一般在1-100mg/L。近年來有報道稱HEK293細胞中瞬時表達產(chǎn)量可達1g/L。
與瞬時轉(zhuǎn)染不同，穩(wěn)定細胞株是為工業(yè)化生產(chǎn)治療性蛋白而構(gòu)建的。穩(wěn)定細胞株需要具備在不同的時間，不同的場地以及不同的批次間生產(chǎn)相同質(zhì)量產(chǎn)品的能力。在選定生產(chǎn)用細胞株之后，需要建立主細胞庫（mater cell bank）。從主細胞庫復(fù)蘇后，擴增建立工作細胞庫（working cell bank），工作細胞庫用于生產(chǎn)。細胞庫通常保存在液氮中，需要維持整個產(chǎn)品的生命周期。在構(gòu)建生產(chǎn)用細胞株的過程中，宿主細胞和表達載體至關(guān)重要。
穩(wěn)定細胞株構(gòu)建---高產(chǎn)細胞株的秘密
CHO和骨髓瘤細胞是構(gòu)建穩(wěn)定細胞株*常用的兩種宿主細胞。基本上用這兩類細胞生產(chǎn)的治療性蛋白都能分泌到細胞外，從而可以從細胞培養(yǎng)液中收獲產(chǎn)物。 CHO細胞屬于成纖維細胞，是一種非分泌型細胞，它本身很少分泌內(nèi)源蛋白。
科研人員在蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平上研究了B細胞變成漿細胞所發(fā)生的生理變化。細胞轉(zhuǎn)變提高了能量代謝水平，改善了蛋白分泌和糖基化能力，同時增加了氧化還原水平用來應(yīng)對活性氧的影響。B細胞或漿細胞的基因組中只有一個功能性的免疫球蛋白基因。在B細胞成熟的過程中，二倍體細胞中其中一個等位基因發(fā)生失活。但是，僅僅是免疫球蛋白基因的一個拷貝足以使?jié){細胞成為一個高產(chǎn)的分泌細胞。因此，只需將目的基因的一個拷貝整合到雜交瘤細胞基因組適合的位置就可以使其成為分泌外源蛋白的強大細胞。與瘤細胞不同，CHO必須經(jīng)過改造后才能提升蛋白表達能力。
除了蛋白表達能力之外，優(yōu)良的細胞株還應(yīng)具備良好的生長和代謝特性。在過去的十多年里，大量轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的研究致力于揭示高產(chǎn)細胞株的特性。人們逐漸意識到?jīng)]有那一種主要的調(diào)控因素能使CHO或NS0來源的重組細胞變成高產(chǎn)細胞株。高產(chǎn)細胞株的形成涉及細胞內(nèi)許多通路的改變，比如代謝、分泌、氧化還原平衡和生長/死亡調(diào)控；更可能的是大量基因表達水平的微小變化，而不是幾個主要節(jié)點的大變化。
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